Como todos os felinos, a onça-pintada é um carnívoro obrigatório, se alimentando somente de carne. É um caçador oportunista, e sua dieta inclui até 87 espécies de animais. A onça pode predar, teoricamente, qualquer vertebrado terrestre ou semiaquático nas Américas Central e do Sul, com preferência por presas maiores. Ela regularmente preda jacarés, veados, capivaras, antas, porcos-do-mato, tamanduás e até mesmo sucuris. Entretanto, o felino pode comer qualquer pequena espécie que puder pegar, como ratos, sapos, aves (principalmente mutuns), peixes, preguiças, macacos e tartarugas. Um estudo conduzido no Santuário de Cockscomb, em Belize, revelou que a dieta das onças era constituída principalmente por tatus (dasipodídeos; clamiforídeos) e pacas. Mas, por ter preferência a áreas próximas a cursos d'água, a onça-pintada acaba se alimentando preferencialmente de ungulados como a queixada (Tayassu pecari) e a anta (Tapirus terrestris).
 

Alguns estudos têm sido conclusivos de que a onça-pintada ataca o gado doméstico quando suas presas habituais, como a queixada (Tayassu pecari), tornam-se mais raras. Pelo grande porte, é capaz de se alimentar até de outros felinos de tamanho menor, como a jaguatirica (Leopardus pardalis), apesar de ser incomum.Outros carnívoros, como o lobo-guará (Chrysocyon brachyurus), o cachorro-do-mato (Cerdocyon thous), o quati (Nasua nasua) e o mão-pelada (Procyon cancrivorus) também podem ser predados pela onça-pintada, e ela é o principal predador desses animais.
 

A onça-pintada raramente mata com uma mordida no pescoço, sufocando a presa, como é típico entre os membros do gênero Panthera, preferindo matar por uma técnica única entre os felinos: ela morde o osso temporal no crânio, entre as orelhas da presa (especialmente se for uma capivara) com os caninos, acertando o cérebro. A mordida na cabeça é empregada em mamíferos, principalmente, enquanto que em répteis, como jacarés, a onça-pintada ataca o dorso do animal, acertando a coluna cervical, imobilizando o alvo. Embora capaz de rachar o casco de tartarugas, a onça pode simplesmente esmagar o escudo com a pata e retirar a carne.  O felino anda de forma lenta, ouvindo e espreitando a presa, antes de armar a emboscada ou atacá-la. Ela ataca por cima, através de algum ponto cego da presa, com um salto rápido: as habilidades de espreita e emboscada dessa espécie são consideradas inigualáveis.  A necessidade diária alimentar de um indivíduo com 34 quilos (que é menor peso encontrado em um indivíduo adulto) é de 1,4 quilos. Para animais em cativeiro, pesando entre 50 a 60 quilos, mais de 2 quilos de carne são recomendados. Em liberdade, o consumo é naturalmente mais irregular: felinos selvagens gastam considerável energia e tempo para obter alimento, e podem comer até 25 quilos de carne de uma só vez, seguidos por longos períodos sem se alimentar.